fa تولید رده سلولی ناک اوت IDUA توسط تکنیک ویرایش ژنی CRISPR/Cas ژنتیک ژنتیک پژوهشي اصیل Original Research <div style="text-align: justify;"></div> <table align="right" border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" dir="rtl" style="width:596px;border-collapse:collapse;margin-left:6.75pt;margin-right:6.75pt;" width="596"> <tbody> <tr style="page-break-inside:avoid;height:1px;"> <td style="width: 596px; padding: 0cm 5.4pt; height: 1px; vertical-align: top; text-align: justify;"><span style="font-family:Tahoma;"><strong><span style="color:windowtext;"><span style="font-size:12.0pt;">مقدمه:</span></span></strong> <span style="font-size:10.0pt;">موکوپلی ساکاریدوز تیپ</span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;(MPSI) I </span></span><span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;بیماری شایع ذخیره ای لیزوزومی است که به واسطه کمبود</span>&nbsp;<span style="font-size:10.0pt;">آنزیم آلفا-ال &ndash; ایدورونیداز&nbsp; </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">(IDUA)</span></span> <span style="font-size:10.0pt;">بر روی کروموزوم 4 (</span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">4p16.3</span></span><span style="font-size:10.0pt;">) ایجاد می گردد. این آنزیم در تجزیه</span>&nbsp;<span style="font-size:10.0pt;">گلیکوزآمینوگلیکانها یا موکوپلی ساکاریدهای درماتان سولفات و هپاران سولفات دخالت</span>&nbsp;<span style="font-size:10.0pt;">دارد و نقص در آنزیم مذکور منجر به افزایش سطح گلیکوز آمینو گلیکان ها</span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;"> (GAG) </span></span><span style="font-size:10.0pt;">در خون و تجمع آن در اعضای مختلف بدن می شود</span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">.</span></span> <span style="font-size:10.0pt;">این ترکیبات پروتئوگلیکانی زیربنای ساختاری ماتریکس خارج سلولی و ساختار غضروفی نقاطی مثل مفاصل، دریچه</span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">&shy;</span></span><span style="font-size:10.0pt;">های قلبی را فراهم می</span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">&shy;</span></span><span style="font-size:10.0pt;">نماید؛ بعلاوه در تنظیم ارتباطات سلولی نقش دارد. در این مطالعه ما سیستم </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">CRISPR/Cas</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> را طراحی کردیم که ژن کد کننده انزیم </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">IDUA</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> را مورد هدف قرار داده</span> <span style="font-size:10.0pt;">&nbsp;است و ما توانستیم سلوهای ناک اوت این ژن را تولید کنیم.</span></span><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:6.0pt;"></span></span></td> </tr> <tr style="page-break-inside:avoid;height:1px;"> <td style="width: 596px; padding: 0cm 5.4pt; height: 1px; vertical-align: top; text-align: justify;"><span style="font-family:Tahoma;"><span style="color:windowtext;"><span style="font-size:12.0pt;"><strong>مواد و روش &shy;ها</strong>: </span></span><span style="font-size:10.0pt;">ابتدا </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">sgRNA</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> هدف </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">IUDA</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> در پلاسمید </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">px335</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> کلون شد، با استفاده از نقشه برداری محدودکننده، پلاسمید نوترکیب تأیید شد. سپس پلاسمید نوترکیب به رده سلولی اپیتلیال انسانی، </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">HEK-293</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> ترانسفکت شد. کلون های جهش یافته توسط آنالیز </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">melting</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> غربالگری شدند و جهش آنها با تعیین توالی سنگر مشخص شد.</span></span><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:6.0pt;"></span></span></td> </tr> <tr style="page-break-inside:avoid;height:1px;"> <td style="width: 596px; padding: 0cm 5.4pt; height: 1px; vertical-align: top; text-align: justify;"><span style="font-family:Tahoma;"><span style="color:windowtext;"><span style="font-size:12.0pt;"><strong>یافته&shy; ها:</strong> </span></span><span style="font-size:10.0pt;">هضم آنزیمی و تعیین توالی سنگر، القای جهش ایندل را در دو کلون هتروزیگوت و یک کلون هموزیگوت تایید کرد.</span></span><span style="color:windowtext;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span></td> </tr> <tr style="page-break-inside:avoid;height:1px;"> <td style="width: 596px; padding: 0cm 5.4pt; height: 1px; vertical-align: top; text-align: justify;"><span style="font-family:Tahoma;"><strong><span style="color:windowtext;"><span style="font-size:12.0pt;">بحث و نتیجه&shy; گیری</span></span>:</strong> &nbsp;<span style="font-size:10.0pt;">در این مطالعه، ما با استفاده از سیستم </span><span dir="LTR"><span style="font-size:10.0pt;">CRISPR-Cas9</span></span><span style="font-size:10.0pt;"> یک مدل سلولی سندرم هورلر تولید کردیم که این مدل می تواند جهت استفاده در رویکرد های درمانی این بیماری استفاده شود.</span></span><span style="color:windowtext;"><span style="font-family:B Nazanin;"><span style="font-size:10.0pt;"></span></span></span></td> </tr> </tbody> </table> <div style="text-align: justify;"><div style="clear:both;"></div></div> <div style="text-align: justify;"><strong><em>Background</em></strong><strong>:</strong> The hurler syndrome is the most common form of lysosomal storage diseases (LSDs). In the present experiment, we intended to generate an IDUA targeting CRISPR-Cas system and deactivate the target gene using it.<br> <strong><em>Materials and Methods:</em></strong> IUDA targeting sgRNA pair were cloned into the px335 plasmid and resulted plasmid identity was confirmed using restriction mapping. Recombinant plasmid was transfected into the human epithelial cell line, HEK-293. Mutated clones were screened by melting analysis and their mutation was characterized by Sanger sequencing.<br> <strong><em>Results:</em></strong> Analytical digestion and Sanger sequencing confirmed indel mutation induction in two clones in heterozygote and one clone in homozygote state.<br> <strong><em>Conclusion:</em></strong> In this study, we produced an IDUA knockout cell model using CRISPR-nCas9 system. This model can be used in the therapeutic approaches of this disease. <span dir="RTL"></span></div> سندرم هرلر, CRISPR-Cas , ژن ناک اوت , IDUA Hurler syndrome, CRISPR-Cas, Gene knock out, IDUA 162 169 http://yafte.lums.ac.ir/browse.php?a_code=A-10-2784-1&slc_lang=fa&sid=1 Ali Hatami bardar علی حاتمی بردر Ali.net1@yahoo.com 7200319475328460021022 7200319475328460021022 No Department of Biology, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran گروه زیست شناسی، واحد مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی، مرودشت، ایران Mohsen Azimi nejad محسن عظیمی نژاد AzimiNM@mums.ac.ir 7200319475328460021023 7200319475328460021023 No Department of Basic Medical Sciences, Neyshabour University of Medical Sciences, Neyshabour, Iran. گروه علوم پایه پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی نیشابور، نیشابور، ایران Mojtaba Jafarinia مجتبی جعفری نیا Jafarinia33@gmail.com 7200319475328460021024 7200319475328460021024 No Department of Biology, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran گروه زیست شناسی، واحد مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی، مرودشت، ایران Hamid reza Goodarzi حمید رضا گودرزی Drgoodarzi.lab@gmail.com 7200319475328460021025 7200319475328460021025 No Department of Biology, Marvdasht Branch, Islamic Azad University, Marvdasht, Iran گروه زیست شناسی، واحد مرودشت، دانشگاه آزاد اسلامی، مرودشت، ایران Majid Mojarrad مجید مجرد Mojaradm@mums.ac.ir 7200319475328460021026 7200319475328460021026 Yes Department of Medical Genetics, School of Medicine, Mashhad University of Medical Sciences, Mashhad, Iran گروه ژنتیک پزشکی، دانشکده پزشکی، دانشگاه علوم پزشکی مشهد، مشهد، ایران